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大鼠急性期腦炎癥應的影響分析(QL-902使用)

返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-19 10:15【

腦出血(ICH)是較為嚴重的一種急性腦血管疾 病,約占全部腦卒中的10%~17%。本病發病死亡率高,在北美,ICH患者發病30 d內的死亡率約為44%, 僅有20%的患者預后良好。ICH患者的神經功能損 傷一般較為嚴重,急性期多伴有頭痛、單側虛弱、嘔吐、 癲癇和意識障礙等癥狀,即便好轉之后常會遺留肢體 不遂,語言、感覺障礙等嚴重問題。血液破入腦實質或腦室,不僅直接損傷神經系統,而且出血所觸發的炎癥 信號會引起促炎癥細胞因子如細胞間黏附分子-1 (ICAM-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)的表達異常,從而 產生炎癥級聯反應,造成神經功能繼發性損傷。本實 驗采用自體血注射所制備的大鼠ICH模型,以針刺水 溝、內關為干預方法,觀察不同針刺施術時長下ICH急 性期大鼠腦血腫周圍區域ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL6、HSP70含量的變化規律,從炎癥反應與腦組織保護 角度,探究不同針刺量學條件下的作用機制。現報告 如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康的 SPF 級 8 周齡左右雄性 SD大鼠共40只,體質量(300±25)g。實驗大鼠由北京 維通利華實驗動物技術有限公司提供,實驗動物生產 許可證號:SCXK(京)2016-0002。于中國醫學科學院 放射醫學研究所飼養,實驗動物使用許可證:SYXK (津)2014-0002。環境溫度20~25 ℃,晝夜規律飼養。

1.2 試藥與儀器

小鼠單克隆抗體 ICAM-1(Abcam 公司,編號 171123)、小鼠單克隆抗體 TNF-α(Abcam 公司,編號 220210)、兔多克隆抗體 IL-1β(Abcam 公 司,編號9277)、小鼠單克隆抗體IL-6(Abcam公司,編 號9324)、小鼠單克隆抗體HSP-70(Abcam公司,編號 2787);蘇木素、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物 技術有限公司);渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司,型號其林貝爾QL-902);恒溫水浴箱(江蘇太倉醫 用儀器廠,型號 DSHZ-300);離心機(Eppendorf 公司, 型號5430);石蠟切片機(萊卡公司,型號RM2015);顯 微鏡(奧林巴斯公司,型號:BX51T-PHD-J11);醫用X 射線膠片(柯達公司);多功能真彩色細胞圖像分析管 理系統(Media Cybernetics公司,Image-Pro Plus);針灸 針(華佗牌,規格0.25 mm×40 mm)。

1.3 分組與造模

采用 SPSS19.0 軟件系統產生隨機 數法將48只大鼠隨機分為4組,假手術組、模型組、針 刺5 s組、針刺60 s組,每組10只。Sham組于術后次日 開始模擬針刺組的捉抓過程,每日1次;模型組于造模 成功后次日開始模擬針刺組的捉抓過程,每日1次;針 刺組于造模成功后次日開始針刺干預,每日1次。大 鼠在干預5 d后(假手術、造模后第6日)斷頭取腦,制 備石蠟切片和凍存樣品。本次實驗對實驗動物的處理 符合國際獸醫學編輯協會編纂的《關于動物倫理與福 利的作者指南共識》。采用尾狀核自體血注入法制作 ICH 模型。大鼠經 10%水合氯醛水溶液腹腔注射麻 醉,劑量為300 mg/kg,麻醉后剃除頭頂毛;斷尾取血并 將血擠入抗凝管內,用微量注射器抽入微量注射器 (100 μL)中備用。俯臥位,固定其于大鼠腦立體定位儀,先固定耳間線,移頭部至正中,固定門齒于齒溝上, 調整腦定位儀,使門齒溝平面略低于耳間線平面;碘伏 溶液皮膚消毒后沿正中皮膚、肌肉剪開約1.5 cm縱向 切口,血管鉗分離,過氧化氫水溶液拭去顱骨骨膜,顯 露顱骨,暴露顱骨上的前囟和冠狀縫區域,此時大鼠尾 部正對實驗者,以前囟為原點,在向前旁開2 mm,向右 旁開 3 mm 處,用直徑 1 mm 骨鉆鉆孔,孔直徑約為 1 mm,以不損傷腦組織,鉆尖下落空感為度;將定位儀 上的微量注射器針尖移至要注射的部位,緩慢進針 5 mm,向尾狀核內緩慢(7 mins)注入50 μL自體全血, 留針 10 mins 后將注射針緩慢退出,并用骨蠟封閉鉆 孔,縫合皮膚、肌肉并用碘伏溶液消毒防止創口感染; 置于溫度適宜處自然蘇醒,此過程應保持大鼠自主呼 吸。麻醉蘇醒后,大鼠出現或不立即出現神經功能缺 損癥狀,歸籠飼養,次日出現明顯神經功能缺損癥狀, 認為造模成功。Sham組模擬皮膚、顱骨創傷過程但不 刺入腦組織。

1.4 針刺方法

兩針刺組均選取大鼠“水溝”穴、雙側 “內關”穴,大鼠腧穴定位根據中國針灸學會實驗針灸 研究會編寫的《動物針灸穴位圖譜》中的“水溝”“內關” 穴位置;水溝穴采用“雀啄”法,內關穴采用捻轉瀉法; 針刺5 s組各穴施快頻率(3次/s)手法5 s,針刺60 s組 各穴施快頻率(3 次/s)手法 60 s,刺畢不留針,每日 1 次,共5次。

1.5 標本采集與檢測

1)各組取5只大鼠麻醉,行4% 多聚甲醛內固定術,打開胸腔暴露心臟,在右心耳剪開 小口,經左心室插入導管至升主動脈,顯露導管;注射 200 mL 0.9%氯化鈉注射液沖洗血液至心耳處流出清 水,肝臟顏色變淺;再經150 mL 4%多聚甲醛灌注至肝 臟、四肢、尾部僵硬 。斷頭處死后,在冰板上迅速開顱 取腦,放置于4%多聚甲醛溶液中待測;每只取血腫區 及周圍腦組織約100 mg,制備免疫組化切片;
2)另取5 只大鼠,斷頭取腦,分離血腫區及周圍腦組織作蛋白質 印跡法(Western blotting)分析腦血腫區 HSP-70 蛋白 表達;免疫組化法檢測腦血腫區ICAM-1、TNF-α、IL1β、IL-6含量。

1.6 統計學處理

應用 SPSS19.0 統計軟件。計量資 料以(x±s)表示,樣本定量分析應用單因素方差分析, 方差齊時用LSD檢驗,方差不齊時使用Dunnett′-T3 檢 驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

假手術組ICAM-1陽性細胞為生理性表 達;與假手術組比較,模型組、針刺5 s組、針刺60 s組 ICAM-1表達增強;與模型組比較,針刺5 s組ICAM-1 表達差異無統計學意義(P > 0.05);針刺60 s組表達減少(P < 0.05)。假手術組IL-6陽性細胞為生理水平表達; 與假手術組相比,模型組、針刺5 s組、針刺60 s組IL-6 表達增強;與模型組比較,針刺5 s組、針刺60 s組IL-6 表達減少(P < 0.05),且針刺 60 s 組降低更明顯(P < 0.05)。

3 討 論

ICH在中醫理論中可歸于“中風”病范疇,中醫經 典中也以“大厥”“薄厥”“仆擊”“風痱”“偏枯”等名稱記述,病勢多較危急,本病病因正氣虧虛,情志、飲食、勞 倦內傷,病機為氣血逆亂,血溢腦脈之外,產生風、火、 痰、瘀等病理產物,以突然昏仆、口舌歪斜、半身不遂、 言語謇澀或失語等癥狀為主要臨床表現,有中經絡、中 臟腑之分。針刺是 ICH 急性期臨床上廣泛應用的療 法,其中研究較多的具體方法主要有醒腦開竅針法與 頭皮針透刺法,本實驗以醒腦開竅法為基礎,以醒腦開 竅主穴“水溝”“內關”穴為干預腧穴,探究在不同手法 作用時長下的大鼠腦組織炎癥反應因子的含量變化。



 


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