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測定油菜薹中反式維生素-其林貝爾搖床使用

返回列表 來源:未知 發布日期:2019-12-27 10:01【

1 材料與方法 


1. 1 材料與試劑

 20份油菜薹(甘藍型油菜,Brassica napus L.)樣 品采摘自中國農業科學院油料作物研究所試驗基 地,其它蔬菜小白菜(上海青,B. rapa spp. chinen? sis)、西蘭花(B. oleracea var. Italic Planch)和結球甘 藍(B. oleracea var. capitata)購買自實驗室周邊5個 超市和蔬菜市場。順式維生素K1、反式維生素K1和 維生素 K1-D7 標準品購自加拿大 Toronto Research Chemicals公司;甲醇(色譜純):賽默飛世爾科技(中 國)有限公司;正己烷(色譜純):國藥集團化學試劑 有限公司;乙酸乙酯(色譜級):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;異丙醇:德國默克股份兩合公司; 甲酸:上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲酸銨: 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;Mega Bond Elut AL-N:美國Agilent公司;Mega BE-SI:美國Agi? lent 公司;Hicapt Benzo:維泰克科技(武漢)有限公 司 ;DIKMA ProElut C18:迪馬科技 ;Simon Aldrich PCX:德國 Simon Aldrich 公司 ;Sep-Pak Vac Silica Cartridges:美國 Waters 公司;DIKMA ProElut SI:迪 馬科技;Waters WCX:美國Waters 公司。

1. 2 儀器與設備

Waters YMC C30液相色譜柱(150 mm×4. 6 mm× 3 μm):日本YMC株式會社;液相色譜三重四級桿串 聯質譜儀:美國賽默飛世爾科技有限公司;3205 食品加工機:德國 Braun 公司(產地:匈牙利);AUW220D 電子分析天平:日本島津公司;移液槍(100 μL、200 μL、1 mL、5 mL):德國 Eppendorf 公司;XHC旋渦混勻器:常州未來儀器制造有限公司;HITA? CHI CT6E 離心機:日本日立有限公司;DTC-27J 超 聲波水浴鍋:中國湖北鼎泰生化技術設備制造有限 公司;BCD-260WDBD型冰箱:青島海爾股份有限公 司;Test Tube Shaker KB-5010 搖床:海門市其林貝爾儀器制造有限公司;BF-2000型氮氣吹干儀:北京 八方世紀科技有限公司;50 mL具塞離心管:美國康 寧公司;10 mL 具塞離心管:中國上海貿易公司;一 次性無菌注射器:武漢市王冠醫療器械有限責任公 司;0. 22 μm 有機系濾膜:美國 Millipore 公司;250 μL玻璃內襯管:安捷倫科技有限公司;1. 5 mL進樣 小瓶:美國Agilent公司。

1. 3 方法

1. 3. 1 標準溶液的配制

準確稱取標準品順式維 生素K1、反式維生素K1各50 mg于深棕色玻璃瓶中, 分別用色譜級甲醇溶解,定容至10 mL,混合均勻配 制成5 mg/mL的單一標準儲備液。 準確稱取1 mg維生素K1-D7同位素標準品于深 棕色玻璃瓶中,加入甲醇定容至10 mL,混合均勻配 制成 100 μg/mL 的維生素 K1-D7 同位素內標儲備 溶液。 使用移液槍準確移取母液于棕色瓶中,加入純 甲醇進行逐級稀釋,配制成所需不同濃度的單一標 準品溶液以及混合標準品溶液(不同濃度的混合標 準 品 溶 液 均 含 有 50 ng/mL 維 生 素 K1-D7 ),儲 存 于-20℃冰箱中,備用。

1. 3. 2 樣品制備、提取及測定

樣品應新鮮,洗凈 后,擦去表面水分,用食品加工機制成勻漿保存于 冰箱待用,用時置于室溫下解凍。 準確稱取 0. 5 g 蔬菜勻漿樣品于 50 mL 具塞離 心管中,加入 250 ng的同位素內標維生素 K1-D7,加 入5 mL異丙醇,渦旋混勻后超聲5 min。加入10 mL 正己烷,渦旋振蕩 10 min,然后以 4500 r/min 轉速離 心6 min,將上清液轉移至50 mL具塞離心管中。再 向下層溶液加入 10 mL 正己烷重復提取一次,在渦 旋混勻器上將沉淀旋開,振搖 10 min 后,以 4500 r/ min轉速離心6 min。合并上清液,正己烷定容至25 mL。然后用移液槍移取 5 mL 上清液于 10 mL 試管 中,氮氣吹干后加入1 mL正己烷溶解,待凈化。 中性氧化鋁柱用5 mL正己烷活化后,將上述正己烷復溶的1 mL提取液以1. 0 mL/min流速過柱,用 5 mL 正己烷以 1. 0 mL/min 流速淋洗小柱,最后用 8 mL正己烷:乙酸乙酯(80:20,V:V)溶液洗脫至10 mL 試管中,氮氣吹干后加入 1 mL 甲醇復溶,經 0. 22 μm 有機濾膜過濾至 1. 5 mL 進樣小瓶中,待 HPLCMS/MS分析。


2 結果與分析


油菜薹等蔬菜屬于低脂性樣品,但樣品中葉綠 素、類胡蘿卜等干擾物質含量較高,因此,檢測前需 選取合適的固相萃取柱對提取液進行凈化。本文 考察了 DIKMA ProElut C18,Waters WCX,Simon Al? drich PCX,Hicapt Benzo,DIKMA ProElut SI,Mega BE-SI,Sep-Pak Vac Silica Cartridges,Mega Bond Elut AL-N 8種常用的固相萃取柱。考察8種SPE柱 對正己烷提取液的凈化效果。圖 1 結果表明,中性 氧化鋁柱(圖 1中第 5個柱)對蔬菜基質的凈化效果 明顯優于其它7種固相萃取柱。中性氧化鋁柱洗脫 液顏色較淺,進一步說明其吸附葉綠素等干擾物質 能力強,凈化效果好。中性氧化鋁柱用于保留或去 除極性化合物,適用于醛、酮、醌和硝基化合物以及 在堿性介質中不穩定的物質的分離,因此,選擇中 性氧化鋁柱用于維生素K1的凈化分析。


3 討論

建立了油菜薹中維生素 K1順反異構體的分析 檢測方法。采用異丙醇和正己烷對油菜薹樣品進 行提取后,再用氧化鋁固相萃取柱凈化,能有效分 離維生素 K1,凈化除去葉綠素、類胡蘿卜素等干擾 物。選用維生素 K1-D7同位素作為內標進行定量, 可有效消除基質效應,提高回收率和檢測靈敏度。 通過 HPLC-MS/MS 選擇反應監測模式(SRM),可以 降低噪音和基質背景,提高檢測的靈敏度。與國標 法相比本實驗實現了利用 C30色譜柱對順反式維生 素 K1進行分離。本方法中順式維生素 K1和反式維 生素 K1的檢出限分別為 0. 49 μg/kg、0. 29 μg/kg,定 量限分別為 1. 63 μg/kg、0. 95 μg/kg,相關系數均≥ 0. 9978,加標回收率在 87. 5%~117. 6% 之間,精密 度(RSD)在0. 72%~9. 59%之間。該方法樣品富集 凈化操作簡單、靈敏度高、結果準確,能夠滿足蔬菜 中維生素 K1順反異構體的檢測。




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